当前位置： 冠状动脉疾病 > 冠状动脉疾病发作 > 抑制FURIN能够减轻小鼠的血管重塑和动
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摘要
目的：动脉粥样硬化冠状动脉疾病史全世界死亡的主要原因，目前对其治疗仍不理想。通过对大型冠心病病例对照队列进行系统网络荟萃分析，我们发现PCSK3（前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin家族成员3；FURIN）是冠心病相关途径的成员。因此本次实验的目的是确定FURIN在动脉粥样硬化中的作用。
方法和结果：在体外，FURIN抑制剂能够减少单核细胞迁移，巨噬细胞和血管内皮细胞炎症反应和细胞因子基因的表达。在体内，对高脂血症的Ldlr-/-小鼠给予FURIN的抑制剂α-1-PDX处理可缩小动脉粥样硬化病变范围，并能减少严重病变，还能明显减少巨噬细胞和胶原蛋白，以及全身性的炎症标记物表达。MMP2(基质金属肽酶2)，是一种能够显示内皮功能和动脉粥样硬化病变进展的效应物，我们发现抑制剂治疗的小鼠的主动脉中的FURIN表达显著降低。为了确定FURIN在血管内皮功能中的作用，我们对伴有颈总动脉损伤的Apoe-/-小鼠给予α-1-PDX治疗。结果显示a-1-PDX显著降低了颈动脉内膜厚度,减少了斑块,降低了平滑肌细胞，巨噬细胞和炎症标记物含量，提示α-1-PDX可以改善血管重塑。该模型中FURIN过表达能够导致内膜斑块厚度显著
增加67%，这证实了FURIN与动脉粥样硬化直接相关。
结论：我们的结果表明FURIN的系统性抑制能够减少小鼠的血管重塑和动脉粥样硬化。FURIN可能是通过介导MMP2来起到血管的保护作用。
名词解释
Atherosclerosis(AS)：动脉粥样硬化,是最常见和最具有危害性的疾病，是动脉硬化的一种，大、中动脉内膜出现含胆固醇、类脂肪等的黄色物质，多由脂肪代谢紊乱、神经血管功能失调引起,动脉粥样硬化多见于40岁以上的男性和绝经后的女性，本病常伴有高血压、高胆固醇血症或糖尿病，脑力劳动者较多见，对健康危害甚大，为老年人主要病死原因之一。
Cardiovasculardisease(CVD)：心血管疾病，是心脏和血管疾患引起的，包括冠心病(心脏病发作)、脑血管疾病(中风)、高血压、周围血管疾病、风湿性心脏病、先天性心脏病、心力衰竭以及心肌病等。
Furin：弗林蛋白酶，类似于细菌枯草蛋白酶、酵母Kexin的一种内切蛋白酶。年Fuller通过序列搜索和。分析发现人的fur基因位于原癌基因c-fes/ps近而命名，Furin可以识别剪切多种蛋白质，如生长因子、血清蛋白、基质金属蛋白酶、受体、病毒囊膜蛋白和细菌外毒素等。
前言
动脉粥样硬化性冠状动脉疾病（CAD）是全球人类的主要的死亡原因，目前的治疗方法还不能完全有效的治疗CAD，因此需要人们寻求新的治疗这种疾病的方法。
当前的治疗CAD主要在于控制危险因素，例如高胆固醇血症和高血压，但没有直接针对动脉粥样硬化发生机制的治疗方法。
FURIN(PCSK3)是前蛋白转化酶家族的成员，可在特定的单个或成对的碱性氨基酸上裂解多个分泌蛋白前体。
FURIN与多种疾病有关。在癌症中，用FURIN抑制剂治疗可减少各种肿瘤和转移。FURIN在骨关节炎患者的软骨中表达增加，用FURIN抑制剂治疗关节炎小鼠模型可降低炎症和关节炎。在体外模型中，FURIN的抑制还可以减少病毒感染。
在人类动脉粥样硬化病变中，若干种细胞类型中的FURI表达都增加了。此外，随着人类病变程度的增加，FURIN表达也增加。对FURIN的特异性抑制能够减少小鼠的动脉粥样硬化病变，此外研究发现FURIN水平与2型糖尿病患者的心血管并发症相关。
在这项研究中，我们在动脉粥样硬化性心血管疾病小鼠模型中通过抑制或者过表达FURIN，证明了系统性FURIN水平与动脉粥样硬化病变的进展直接相关。
方法
相关信号途径和基因表达的综合分析
喂养Ldlr-/-小鼠西方饮食构建动脉粥样硬化模型
一半的小鼠每周两次腹膜内注射1xPBS，另一半则接受ug/kg的FURIN抑制剂（α-1-PDX，RP-；），连续8周。
血清FURIN、炎症标记物和脂质的检测
动脉粥样硬化损伤分析
在整个主动脉根部截取一系列横截面（5-um厚）进行组织学分析。
基质金属肽酶活性测定
解剖主动脉弓，进行速冻，并在RIPA缓冲液中匀浆。
颈动脉损伤模型
细胞培养和分化
使用10ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸酯12-乙酸酯（Sigma-Aldrich）分化THP-1细胞48小时，然后在RPMI(10%FCS，1%L-谷氨酰胺）中分化24小时。
实时逆转录聚合酶链反应
统计分析
符合正态分布的数据，使用Studentt检验分析两组之间的差异。不符合正态分布的数据，则应用MannWhitney检验进行分析。使用单向方差分析和Tukey事后检验比较多个组的差异。对于非参数多重比较，使用Kruskal-Wallis检验。
结果
FURIN与动脉粥样硬化有关的基因组证据
通过对基因和相关途径的分析确定FURIN是6个CAD相关途径的重要组成部分，包括细胞外基质的降解，细胞外基质的组装，翻译后修饰(γ羧化和芳基硫酸酯酶的活化），信号传导PDGF（血小板衍生生长因子），NOTCH信号转导和TGF-B受体复合物信号转导(图1A)。
为了明确FURIN参与脉粥样硬化的更多证据，我们从筛选了与动脉粥样硬化相关的人体研究的大规模基因表达数据，从中检索并分析了涉及个样品的18个微阵列研究。结果表明FURIN在所有与动脉粥样硬化相关的细胞类型和动脉粥样硬化斑块中均高表达（图1B)。
图1.FURIN与冠状动脉疾病(CAD)的遗传学和基因组证据。
图A：与CAD显著相关的常见基因。黑色框中显示的是FURIN的结果。通过对基因和相关途径的分析确定FURIN是6个CAD相关途径的重要组成部分，包括细胞外基质降解，细胞外基质组装，翻译后修饰(γ羧化和芳基硫酸酯酶的活化)，信号传导PDGF(血小板衍生生长因子)，NOTCH信号转导和TGF-B受体复合物信号转导。
图B：对从血管内皮细胞(EC)，血管平滑肌细胞(VSMC)，,单核细胞/巨噬细胞(巨噬细胞)和人动脉粥样硬化斑块(Plaque)提取的个样本的FURIN和其他PCSKs(原蛋白转化酶的枯草杆菌蛋白酶/kexin家族成员)的表达进行了定量分析。为了明确FURIN参与动脉粥样硬化的更多证据，我们筛选了与动脉粥样硬化相关的人体研究的大规模基因表达数据，从中检索并分析了涉及个样品的18个微阵列研究。结果表明FURIN在所有与动脉粥样硬化相关的细胞类型和动脉粥样硬化斑块中均高表达。
抑制FURIN能够减少体外单核细胞迁移和单核细胞/巨噬细胞和血管内皮炎性基因表达
在跨孔迁移分析中，在存在癸酰基-RVKRCMK的情况下，脂多糖激活的单核细胞的迁移显著减少(图2A)，表明FURIN促进了单核细胞的迁移。而且单核细胞迁移的数量减少并不是由于抑制剂治疗组细胞死亡增加（图2B)。为了确定FURIN抑制对炎症和粘附分子表达的影响，我们评估了基因表达水平。结果发现在单核细胞中，在抑制剂存在下，粘附分子VCAM-1的表达显著降低(图2C)。
炎症标记物CCL2，NF-KB和IL1-B以及黏附分子ICAM-1的表达未见变化(图2C)。在脂多糖刺激的单核细胞产生的炎症条件下，观察到了ICAM-1和L1-B表达的显著下降(图2D)，这表明FURIN抑制可能会降低动脉粥样硬化中单核细胞炎症细胞因子和粘附分子的表达。在巨噬细胞中,FURIN抑制剂降低了CCL2,VCAM-1和ICAM-1的表达（图2E)，这表明通过FURIN抑制，炎症趋化因子，细胞因子和粘附分子的表达也可能显著降低。
接下来，我们评估了FURIN对引发炎症的脂多糖的反应，发现巨噬细胞中的FURIN活性显著降低（图2F）。在脂多糖刺激下单核细胞中未观察到FURIN活性的下降（图2F）。
图2.抑制FURIN能够减少体外单核细胞迁移和单核细胞/巨噬细胞和血管内皮炎性基因表达。
图A-B：对活化的人THP-1单核细胞进行迁移和生存活性分析。在存在癸酰基-RVKRCMK的情况下，脂多糖激活的单核细胞的迁移显著减少，表明FURIN促进了单核细胞的迁移，而且单核细胞迁移的数量减少并不是由于抑制剂治疗组细胞死亡的增加而引起的。
图C：FURIN抑制剂处理过的单核细胞中CCL2、ICAM-1、VCAM-1、IL1-β、NF-Kβ的表达水平分析。单核细胞中，在抑制剂存在条件下，粘附分子VCAM-1的表达显著降低，炎症标记物CCL2、NE-Kβ和IL1-β以及黏附分子ICAM-1的表达未见变化。
图D：脂多糖(LPS)刺激单核细胞后，分析CCL2、ICAM、VCAM-1、IL1-β、NF-Kβ的表达水平。LPS刺激单核细胞产生的炎症条件下，观察到ICAM-1和IL1-β的表达显著下降，提示抑制FURIN可能会降低动脉粥样硬化中单核细胞炎症细胞因子和粘附分子的表达。
图E：FURIN抑制剂治疗M-CSF来源的细胞后，分析CCL2、ICAM-1、VCAM-1、IL1-β、NF-Kβ表达水平，结果显示，FURIN抑制剂降低了CCL2、VCAM-1和ICAM-1的表达，提示抑制FURIN可降低炎症趋化因子，细胞因子和粘附分子的表达水平。
图F：THP-1单核细胞和巨细胞的FURIN活性检测。接下来，实验评估了FURIN对引发炎症的脂多糖的反应，发现巨噬细胞中的FURIN活性显著降低，而在脂多糖刺激下单核细胞中未观察到FURIN活性的下降。
使用FURIN抑制剂处理小鼠后降低了血清FURIN水平
给予Ldlr-/-小鼠FURIN治疗后降低了动脉粥样硬化损伤面积和严重性
在FURIN抑制剂治疗组中观察到了总病变面积有降低的趋势（FURIN抑制剂：39.87±5.51；对照组：50.07±6.40xμm2，n=15；P=0.2；图3A和3B）。
在轻度病变区域没有观察到差异（FURIN抑制剂：43.22+9.99；对照组：38.19±8.43xum2,n=15；P=0.7；图3C和3D)。但是，在FURIN抑制剂治疗组中观察到的晚期病变面积明显减少（降低了66%)FURIN抑制剂：14.43±6.26；对照组：42.03±11.87xμm2，n=15，P=0.04；3D图)，这说明了在Ldlr-/-高胆固醇血症模型中，FURIN抑制可减少更成熟的血管病变的形成。
图3.给予Ldlr-/-小鼠FURIN治疗后降低了动脉粥样硬化的损伤面积和严重性。
图A和图C：是主动脉的苏木精伊红组织学染色。
图B：表示小鼠的主动脉窦病变面积的定量分析。
图D：表示小鼠的主动脉严重病变区域分析。
由图可知，FURIN抑制剂治疗组动脉粥样硬化总病变面积有降低的趋势(图A-B)。在病变程度较轻区域没有观察到差异(图C-D)。但是，在FURIN抑制剂治疗组中观察到的晚期病变面积明显减少(图D，降低了66%)，提示在Ldir-/-高胆固醇血症模型中，抑制FURIN可降低血管病变严重程度。
图E：为主动脉窦中巨噬细胞(绿色)的染色分析结果。
图F：表示小鼠的巨噬细胞面积分析。在经FURIN抑制剂处理的小鼠中观察到巨噬细胞(MAC-3)阳性病变区域明显减少(降低了34%)。
图G：为主动脉的胶原蛋白染色。
图H：为小鼠主动脉病变区域的胶原蛋白含量分析，结果显示病灶中成熟的胶原纤维明显减少，说明FURIN抑制剂治疗减少了小鼠病变区域的胶原蛋白。
FURIN抑制减少了Ldlr-/-小鼠动脉粥样硬化损伤的严重性
在经FURIN抑制剂处理的小鼠中观察到巨噬细胞（MAC-3)阳性病变区域明显减少（降低了34%）（FURIN抑制剂：.69±16.45，n=14；对照组：.0.9±12.50，n=15xμm2；P=0.04；图3E和3F）。
此外，染色结果显示病灶中成熟的胶原纤维明显减少（FURIN抑制剂：72.34±7.91；对照组：.19±13.59Xμm2，n=15；P=0.02；图3G和3H），这说明FURIN抑制剂治疗减少了小鼠的病变区域的胶原蛋白。
FURIN抑制减少了Ldlr-/-小鼠的全身性炎症反应
在经FURIN抑制剂治疗的小鼠中，炎症标记TNF-α的血浆水平降低了44%(FURIN抑制剂：1.6±3.1，n=15；对照：38.8±7.5，n=14pg/mL；P=0.05；图4A)。同样，在FURIN抑制剂治疗组中，炎症标记IL1-β的血浆水平也显著降低了（降低66%)(FURIN抑制剂：13.9+2.8，n=15；对照组：40±8.9，n=14pg/ml；P=0.01；图4B)。
此外，我们评估了活性TGF-β1的水平，这是一种在细胞外基质降解中起关键作用的炎性细胞因子，也是FURIN的底物。结果显示在FURIN抑制剂治疗的小鼠中，活性TGF-β1的水平显著降低了(FURIN抑制剂：45.8±5.1，n=16；对照组：62.0±4.6，n=15pg/mL；P=0.02；图4C)。
图4.抑制FURIN减少了小鼠的全身性炎症反应，增加了小鼠的血HDL-胆固醇水平，减少了小鼠的基质金属蛋白酶活性。
图A-D：分别表示对照组小鼠和FURIN抑制剂组小鼠的血清TNF-a、IL1-β、TGF-β1和HDLc水平。结果显示，经FURIN抑制剂治疗的小鼠中，血浆TNF-α(炎症标志物)水平降低了44%(图A)，血浆IL1-β(炎症标志物)水平也显著降低(降低66%)(图B)。此外，FURIN抑制剂治疗的小鼠中，活性TGF-β1水平显著降低(图C)，但HDLc水平显著升高(图D)。图E-G表示两组小鼠主动脉中MMP2和活化的MMP2含量分析。通过明胶酶谱评估，FURIN抑制剂治疗显著降低了小鼠主动脉弓的总MMP2(图E和F)和活性/pro-MMP2表达水平(图E和G)
FURIN抑制增加了Ldlr-/-小鼠的血HDL-胆固醇水平
然而，在接受FURIN抑制剂治疗的小鼠中，HDLc水平显著升高了（FURIN抑制剂：7.4±0.2；对照组：6.6±0.1mmol/L，n=16；P=0.；图4D）。
FURIN抑制减少了Ldlr-/-小鼠的基质金属蛋白酶活性
通过明胶酶谱评估，FURIN抑制剂治疗显著降低了小鼠主动脉弓的中MMP2（FURIN抑制剂：±；对照组：±，n=7；P=0.；图4D和4F）和活性/pro-MMP2的水平（FURIN抑制剂：0.±0.01；对照组：0.18±0.04，n=7；P=0.01；图4E和4G）。
FURIN抑制减少了Apoe-/-小鼠的内膜厚度和斑块范围
FURIN抑制剂治疗的小鼠后，显著降低了内膜厚度(FURIN抑制剂：34.1±7.2；对照组：73.9±7.4xμm2，n=6；P=0.)以及总斑块面积(降低35%；FURIN抑制剂：85.7)11.0；对照组：.5±15.9xμm2，n=6；P=0.04)(图5A5D)，这表明FURIN的抑制可防止Apoe-/-小鼠的血管再狭窄和病变的形成。
图5.抑制FURIN可减少Apoe小鼠的内膜厚度和斑块范围。
图A：为对照组和抑制剂组Apoe-/-小鼠的主动脉染色图片。
图B-D：分别为两组小鼠主动脉斑块面积、内膜厚度和中膜厚度的比较。结果显示FURIN抑制剂治疗的小鼠，内膜厚度以及总斑块面积显著降低，提示抑制FURIN可防止Apoe-/-小鼠的血管再狭窄和病变形成。
图E：为斑块TNF-a免疫荧光染色(绿色)结果。由图可知，抑制FURIN减少了斑块中炎性标志物TNF-α的水平，提示抑制FURIN可减少斑块炎症反应。
图F：为FURIN抑制剂治疗小鼠内皮细胞ICAM-1免疫荧光染色(红色)结果。内皮粘附分子ICAM-1(细胞间粘附分子1)的水平没有变化。
FURIN抑制减少了Apoe-/-小鼠的斑块、巨噬细胞数量和炎症反应
FURIN抑制减少了斑块中炎性标志物TNF-α的水平(FURIN抑制剂：17.5±2.0；对照组：25.8±2.4，n=6；P=0.02；图5E)，表明FURIN抑制可减少斑块炎症反应。在FURIN抑制剂治疗的小鼠中，内皮粘附分子ICAM1(细胞间粘附分子1)的水平没有变化(图5F)。
FURIN抑制剂治疗的小鼠显著降低了动脉粥样硬化病变中的总细胞数(FURIN抑制剂：.6±25.6;对照:.2±45.0细胞/斑块，每个n=6；P0.；图6A)，平滑肌细胞数(FURIN抑制剂：22.4±3.7；对照：54.2±6.3，每组n=6；P=0.；图6B)和巨噬细胞（MAC-2+)数（FURIN抑制剂：74.9±13.5；对照：.5±16.8，每组n=6；P=0.02;图6C)。没有观察到斑块内皮细胞数目（CD31+）的显著差异（图6D)。
图6.抑制FURIN降低了动脉粥样硬化损伤中的斑块复杂性。
图A-D分别为主动脉病变中的总细胞数、平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞的免疫荧光染色。结果显示FURIN抑制剂治疗的小鼠,动脉粥样硬化病变中的总细胞数(图A)，平滑肌细胞数(图B)和巨噬细胞(MAC-2+)数(图C)均显著降低。但没有观察到斑块内皮细胞数目(CD31+)的显著变化(图D)。
FURIN过表达能够增加Apoe-/-小鼠的斑块范围
FURIN过表达能够增加Apoe-/-小鼠的颈动脉内膜厚度(FURIN：.50±8.91；对照组：75.59±11.05xμm2，n=5-6；P=0.)和总病变面积(FURIN：.63±7.82；对照组：.57±xμm2,n=5-6；Р=0.)(图7A-7C)，这说明了FURIN的水平与血管重塑和病变发展直接相关。
除了内膜病变面积和厚度，我们还评估了这些小鼠病变中的巨噬细胞和平滑肌含量。FURIN过表达显著增加了病变滑肌面积(FURIN：51.01±5.33；对照组：32.58±4.66xμm2，n=18-19；P=0.01；图7D)。然而，未观察到病变巨噬细胞(MAC-2+)区域的变化(FURIN：23.40±2.50；对照：24.69±3.80×μm2，n=18-19；P=0.77图7E)。
图7.FURIN过表达能够增加Apoe-/-小鼠的斑块范围。
图A-C：分别为对照组和FURIN过表达Apoe-/-小鼠的主动脉染色图片，内膜面积比较和斑块面积比较分析。结果显示，FURIN过表达能够增加Apoe-/-小鼠的颈动脉内膜厚度和总病变面积，提示FURIN的水平与血管重塑和病变发展直接相关。
图D-E：分别为对照组和FURIN过表达Apoe-/-小鼠的平滑肌细胞(红色)和巨噬细胞(MAC2+)(绿色)的免疫荧光染色结果。由图可知，FURIN过表达显著增加了病变区平滑肌细胞面积,而病变区巨噬细胞面积没有显著的变化。
总结
本研究结果表明，FURIN的系统性抑制能够减少小鼠的血管重塑和动脉粥样硬化，其机制可能是通过介导MMP2来起到血管的保护作用。
讨论
模型和血管内皮重塑的颈动脉损伤小鼠模型中，前蛋白转化酶FURIN的水平与动脉粥样硬化和再狭窄直接相关。我们还发现，对FURIN的全身性抑制能部分地通过调节MMP2活性来阻止小鼠的动脉粥样硬化进程。
在我们的Ldlr-/-小鼠中，FURIN抑制后对早期病变没有影响，但是明显减少了血管晚期的严重病变，这表明FURIN可能在病变发展的后期发挥作用。
FURIN抑制引起的抗动脉粥样硬化作用，除了通过降低MMP2的水平之外，还可能有其他途径，因为FURIN具有多种蛋白质底物。
与FURIN在组织重塑中的重要作用相一致，我们的数据表明FURIN抑制能够降低血管内皮损伤模型，尽管α-1-PDX具有部分非特异性，但在生化、细胞和动物研究中，α-1-PDX能够很好地阻断FURIN的活性。起的动脉粥样硬化病变。
但是，最近对PCSK9的研究表明它可能以旁分泌的方式在动脉壁中起作用。因此，尚不清楚PCSK9是否可以通过独立于LDLR的机制来调节动脉粥样硬化，而也不清楚FURIN是否可以在这些机制中发挥作用。
尽管α-1-PDX具有部分非特异性，但在生化、细胞和动物研究中，α-1-PDX能够很好地阻断FURIN的活性。
我们的发现表明，FURIN的抑制能够阻止动脉粥样硬化和再狭窄。通过抑制FURIN进而阻断血管MMP2活化，起到减轻严重病变的发展和增加斑块稳定性，FURIN的抑制代表了治疗动脉粥样硬化的新选择。
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