三氧疗法可改善冠状动脉疾病患者高密度脂蛋

摘要

冠状动脉疾病（CAD）是最常见的死亡原因。流行病学研究发现，高密度脂蛋白（HDL）的血浆浓度与CAD的发生呈负相关。HDL的质量和功能，而不是数量，似乎是这些颗粒抗动脉粥样硬化特性的重要预测指标。流行病学证据表明，低水平的HDL对氧磷酶活性与心血管疾病的风险增加有关。现在已证明低剂量三氧可以调节抗氧化酶和其他亚细胞活性的证据，并支持其临床应用。本研究的目的是评估三氧治疗对CAD患者对氧磷酶1内酯酶活性和脂质损伤的影响。我们在临床研究中纳入了52位患者。第一组（n=26）通过直肠吹气接受了20次三氧（40μg/mL；mL），而第二组仅用氧气治疗（n=2，对照组）。在研究结束时，我们确定了分光光度法，即对氧磷酶-内酰胺酶活性，以及LDL和血清对脂质过氧化的敏感性。结果表明，三氧治疗能够降低治疗患者的丙二醛水平，同时对氧磷酶1内酯酶活性显着增加（p0.05）。我们的结果表明，三氧可与常规药物联合用于CAD治疗。尽管如此，未来的临床试验对于确定治疗后HD抗氧化剂状态维持多长时间以及重复进行三氧治疗的频率将是必要的。

介紹

冠状动脉疾病（CAD）是最常见的死亡原因。(1)在Framingham研究之前，人们对心血管疾病的危险因素的认识相对较少，Framingham研究还深入了解了高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平与CAD发病率的关系。(2)高密度脂蛋白HDL是脂蛋白颗粒的混合物，密度为1.～1.21g/mL.HDL的主要蛋白成分是载脂蛋白AI(apoA-I)，它在HDL的生物发生和功能中起着关键作用。(3)人类高密度脂蛋白(HDL)对动脉粥样硬化和心血管疾病的发生具有重要作用。(4)经过一些流行病学研究，发现血浆中HDL浓度与CAD的发生率成反比。(5-8)然而，最近的研究结果表明，HDL与心血管风险之间的关系更为复杂，并超越了血浆中HDL的水平。(9)HDL的质量和功能，比数量更重要，似乎是这些颗粒抗动脉粥样硬化特性的重要预测因素。新出现的数据表明，HDL的质量和功能也可能因动脉粥样硬化和其他炎症性疾病而显著降低。(10)除了在调节胆固醇平衡中的关键作用外，HDL还表现出抗氧化和抗炎的特性，参与其一般的抗动脉粥样硬化作用。(4)HDL的抗氧化功能可能取决于其载脂蛋白基团和/或HDL相关蛋白。(11)副氧化酶(PON)是一种HDL相关的钙依赖性酶，能够水解磷脂中的氧化脂肪酸，减少氧化脂质在低密度脂蛋白(LDL)中的积累，通过抑制其促炎反应。(1)流行病学证据表明，PON1活性低与心血管事件和心血管疾病风险增加有关。(12)治疗策略，旨在保留或增加HDL相关的PONmay被确定为动脉粥样硬化治疗的方法。证据表明，抗氧化酶、一氧化氮途径和其他亚细胞活动可以通过低剂量的臭氧调节，现在已经证明，并可以支持在许多病理条件，如CAD的三氧疗法的效果。(13,14)在本研究中，我们推测三氧疗法通过增加PON活性来改善HDL的抗氧化状态，有助于减少脂蛋白的氧化。材料和方法研究设计对照临床试验方案经人体受试研究机构委员会审查批准，程序符合《赫尔辛基宣言》的原则。(15)所有患者在获得有关研究的充分信息(研究的特点、益处和可能的副作用)后，均给予知情同意，同意入组。医务人员被指示报告所有不良体验，无论是否描述了所用药物。年1月至年2月在"IvanPortuondo"医院(古巴阿尔特米萨)就诊的诊断为CAD的成年男女和不同种族的患者均有资格参加研究。排除标准为：严重的败血症、对拟使用的药物过敏、肝功能障碍、肾功能衰竭（血清肌酐水平1.32μmol/L）、妊娠、癌症或其他严重疾病、不能配合研究要求、近期有酗酒或药物滥用史、目前正在接受任何免疫抑制剂或抗惊厥剂治疗、同时参加其他临床研究或正在接受研究药物治疗。对于样本量的计算，采用Gn*Power3系统（3.1版）。(16)类型1的误差为，类型2的误差为，效果率之间的最小差异不高于25%.目标水平的enrollment被确定为每组23例患者。假设10%的研究患者将失去随访机会，每组研究26名患者。将患者随机分为两个不同的组别(1)：在20个疗程中，在交替的日子里，用毫升含有40微克/毫升三氧的O3/O2治疗患者。(2)：对照组患者同样只用mL医用氧治疗。灌注程序NelatonRobinson导管40cm经直肠方式引入10/15cm输送气体，在现场放置5min。鼓励患者在手术前排空自己的膀胱。灌注后立即进行结肠灌肠，以防便秘。医用三氧的产生三氧由三氧研究中心(古巴哈瓦那）的OZOMED设备产生，并通过直肠灌注给药。三氧来自医用级氧气，生成后立即使用，仅占混合气体（O3/O2）的3%左右。三氧浓度是通过使用内置的紫外分光光度计设置在纳米处测量的。LDL和HDL的分离通过不连续密度梯度超速离心从空腹患者的血清中制备LDL和HDL。(17)然后将LDL/HDL对mMNaCl和1mMCaCl2(pH7.4)透析，并按前述方法测定其蛋白质含量。(18)PON1-乳糖酶的活性取5微升1:10(v/v)稀释的HDL，总反应体积为μL。以5-(硫代丁基)丁内酯(TBBL)为底物，测定乳糖酶活性。(19)在nm处用分光光度法测定水解的初始速率。检测混合物包括1mMTBBL和1mMCaCl2在50mMTris-HCl，pH8.0中。从总水解率中减去TBBL的非酶水解。一个单位的乳糖酶活性等于1μmol的TBBL水解/minmL，如前报道。(19)LDL氧化试验LDL氧化试验按以前描述的方法进行(20)，并稍作修改。LDL氧化反应通过加入4μM硫酸铜（在双蒸馏水中）溶液，并在37℃下孵育6小时启动。然后，丙二醛（MDA）浓度测定在nm处使用以前描述的方法。(21)为了计算MDA浓度，采用MDA双(二甲基乙醛)的标准溶液。血清对脂质过氧化的敏感性测定脂质过氧化敏感性由过氧化电位（PP）测定。将血清样品用2mMc硫酸铜溶液在37℃下孵育24小时，然后测定MDA浓度。(22)统计学分析数据采用单因素方差分析(ANOVA)，然后进行同质差异检验(Bartlett-Box)。另外，采用多重比较检验（Duncantest）。结果以平均值±平均值的标准误差（SEM）表示。采用的统计学意义水平为P0.05。实验结果参与研究的患者的一般特征关于基线特征（表1），两组在随机化时相似（P0.05）。两组患者中40%以上的患者年龄在60岁以上，男性居多。他们的病史主要以高血压和缺血性心脏病为特征。生化测定图1所示数据表明，三氧患者PON1-内酰胺酶活性比对照组(仅用氧气灌注)显著增加(P＜0.05)。探讨心血管疾病被认为是全世界死亡的主要原因，而在美国，超过三分之一的死亡是由心血管疾病引起的。(23)因此，开发一个治疗方案，可以减缓甚至逆转动脉粥样硬化势在必行。在这种情况下，三氧治疗，同时应用常规药物，可能代表一个有前途的方法，以纠正氧化应激和改善许多患者的不确定预后。PON1的关键重要性由发现强调，从小鼠中分离出的HDL颗粒，过度表达PON1基因，对铜诱导的脂质过氧化氢形成具有高度的抵抗力。(24)相反，PON1活性的降低与瘦素缺陷和低密度脂蛋白受体缺陷小鼠和糖尿病患者的血脂异常和胰岛素抵抗有关。(25,26)HDL凭借其防止脂质氧化的能力，降低了含apoB的脂蛋白的致病性。(27)除了减少氧化LDL诱导的炎症反应外，HDL还是循环单核细胞内皮细胞粘附分子结合位点的有效抑制剂。(28)此外，在动脉粥样硬化等OS相关疾病下，PON1内酯酶、芳基酯酶、对氧酶的水解活性均失活。(29)增加HDL功能的治疗策略被认为是控制动脉粥样硬化的一个有前途的选择。在这种情况下，三氧疗法代表了一种合理的干预。现在，科学证据表明，应用低剂量的臭氧可以调节抗氧化酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶）。(30)另一方面，Ajamieh和同事证明，三氧-氧化预处理所介导的保护机制涉及蛋白质的合成。(31)ROS浓度升高会诱导许多细胞的基因表达，其产物表现出抗氧化活性。氧化还原平衡的一个主要机制是基于ROS介导的氧化还原敏感信号级联的诱导，导致抗氧化剂的表达增加。(32)上述这些事实支持了目前臭氧治疗的一些临床应用(33)，并允许部分解释PON1乳酸酶活性在三氧治疗的CAD患者中增加的事实。最近，Tavori和同事证明，乳糖酶活性对HDL的抗动脉粥样硬化功能很重要。他们还认为，PON1的抗动脉粥样硬化特性至少可能与清除人类动脉粥样硬化斑块中的斑块氧化脂质有关。(29)低密度脂蛋白的氧化修饰是早期动脉粥样硬化发生过程中的一个关键事件，有助于胆固醇和氧化固醇在动脉壁的积累、泡沫细胞的形成和斑块的发展。(34)ROS诱导损伤的生物标志物不仅有可能确定氧化损伤的程度，而且有可能预测旨在减少这种OS的治疗策略的潜在效率。(13)与PON1乳糖酶活性的增加相一致，在臭氧患者的LDL和血清中，脂质过氧化的减少。我们以前曾报道过，直肠灌注低三氧剂量可诱导CAD中全身MDA和脂质氢过氧化物的减少。(13,14)结论反复直肠灌注三氧有助于增强HDL-PON1乳酸酶的活性，同时减少血脂的氧化损伤。这些观察结果表明，三氧可与常规药物联合使用，用于CAD治疗。未来的临床试验将是必要的，以确定治疗后HDL抗氧化状态能维持多长时间，以及多长时间需要重复三氧治疗。鸣谢作者要感谢古巴阿尔特米萨"IvanPortuondo"医院冠心病重症监护室的工作人员，同时感谢古巴哈瓦那大学药学和食品科学学院的支持。此外，我们还要感谢古巴哈瓦那大学药学和食品科学学院的支持。图1.三氧治疗对PON1乳糖酶活性的影响.星号代表组间的统计学差异（P0.05）。乳糖酶活性是相对于HDL蛋白浓度（mgPr）报告的。三氧治疗对低密度脂蛋白（LDL）和血清脂质氧化的影响。星号代表组间的统计学差异（P0.05）。低密度脂蛋白部分中测定的丙二醛（MDA）浓度相对于低密度脂蛋白浓度（mgPr）进行报告。

参考文献：略

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